在生物制藥領域，蛋白質表達和產量直接影響著藥物研發(fā)和產業(yè)化的進程。然而，一些蛋白質由于其獨特的結構和特性被歸類為“難表達蛋白”，難以在常規(guī)表達系統(tǒng)中實現(xiàn)高效表達。蛋白質難以表達的原因多種多樣，主要涉及分子結構、穩(wěn)定性和細胞環(huán)境等因素。
首先，某些蛋白質具有復雜的三維結構，如高二硫鍵密度或多亞基復合體，使其在合成過程中易于錯誤折疊，進而在細胞中形成不溶性聚集體，影響表達效率。其次，對于高疏水性或需要特定糖基化修飾的蛋白，如膜蛋白、凝血因子等，細胞難以在常規(guī)條件下維持其穩(wěn)定結構，進一步加劇表達困難。此外，某些蛋白質本身具有細胞毒性作用，例如蛋白酶和凝血酶在過表達時會誘導細胞凋亡，導致表達量驟降。外部環(huán)境的影響同樣不可忽視，表達系統(tǒng)中的異常應激反應、代謝物濃度的波動或翻譯后修飾的缺失都會導致蛋白質的不完全表達甚至降解。
以上這些原因共同導致的難表達蛋白藥物的表達量偏低，已經成為生物制藥行業(yè)CMC開發(fā)過程中的主要瓶頸。為解決這一長期存在的產業(yè)難題，漢騰生物研發(fā)了專注于難表達蛋白（Difficult to express protein）的DTEasy工具箱。該平臺以集成優(yōu)化策略為基礎，全面提升難表達蛋白的產量、穩(wěn)定性和功能性，為客戶難表達蛋白藥物開發(fā)提供了一個系統(tǒng)化和全面的解決方案。
DTEasy的四大核心策略
DTEasy平臺通過分子改良、宿主選擇、載體優(yōu)化和工藝構建四個關鍵策略，全方位解決難表達蛋白的表達挑戰(zhàn)。
分子改良
優(yōu)化蛋白質序列，提升穩(wěn)定性與產量
不同分子的表達情況本就有較大差異，我們對不同分子進行序列篩選，對于表達量不高的分子，我們會采用三個步驟對其進行優(yōu)化：
? 密碼子優(yōu)化：通過優(yōu)化密碼子使用，增加分子的表達量。這一策略不改變分子的氨基酸序列，從而保持蛋白質的二級和三級結構不變；
? 序列改造與截短：選擇合適的替代序列，提高分子表達量，并對蛋白質的非功能性片段進行截短，以最大限度保留功能性蛋白，進而提高表達量。此外，我們還可以使用融合標簽蛋白以提高蛋白的溶解度和產量；
? 抗體序列篩選與基因工程優(yōu)化：針對抗體藥物，通過選擇適當?shù)闹劓?輕鏈（VH/VL）框架對，并進行基因工程優(yōu)化以調整重鏈和輕鏈序列，優(yōu)化蛋白質的三維結構，最終提升蛋白質的熱穩(wěn)定性。
在某項目中，我們通過序列風險分析和點突變，成功將細胞池產量提高到原來的7.6倍，且未引起活性改變。
選擇宿主
精心挑選宿主細胞，適配多種蛋白需求
宿主細胞的選擇是難表達蛋白生產的關鍵。DTEasy平臺的宿主選擇策略基于不同蛋白類型和目標應用的特性：
? 優(yōu)先選用哺乳動物細胞：相比其他表達系統(tǒng)，哺乳動物細胞能更好地進行蛋白折疊和二硫鍵形成，確保表達的蛋白具有更高的生物相似性；
? GlycoExpress®（GEX）細胞系：對于需要高度糖基化修飾的內源蛋白，如凝血因子和FSH、GH等激素蛋白，漢騰生物采用專利的GlycoExpress®細胞系（GEX）。該細胞系不僅能提升表達量，其糖基化修飾也更接近人類天然蛋白，適用于具有高度組織特異性的蛋白表達；
例如，在表達G 蛋白偶聯(lián)受體 GPCR 的胞外結構域時，GEX® 細胞系的表達量相比傳統(tǒng)的 CHO-K1 細胞系可提升10倍之多。
通過精準篩選宿主細胞，能最大限度地提高難表達蛋白的產量和質量，確保其在功能上符合藥物開發(fā)的需求。
優(yōu)化載體
構建高效表達載體，提升蛋白合成效率
表達載體的設計會直接影響蛋白合成效率。漢騰生物的DTEasy工具箱通過優(yōu)化一系列措施改造表達載體系統(tǒng)，提升難表達蛋白的產量：
? 引入順式作用元件：通過轉錄組差異表達分析，將與蛋白產量正相關的順式作用元件插入載體中，從而提升轉錄效率；
? 設計多拷貝載體或專用載體：針對不同類型的重組蛋白，通過選用多拷貝載體或定制的難表達蛋白專用載體，可提升100%-400%的蛋白產量。
? 添加共表達抑制劑或配體：加入共表達抑制劑，以減少難表達蛋白表達過程中的細胞毒性，或添加蛋白特定配體以進一步提升表達量，確保表達產量提升到最佳水平。
通過以上組合優(yōu)化設計，DTEasy平臺在難表達蛋白的合成效率和產量上取得顯著提升，滿足了客戶高標準的表達需求。
工藝優(yōu)化
定制化上游工藝開發(fā)方案，顯著提高難表達蛋白產量
在上游工藝開發(fā)中，通過優(yōu)化細胞培養(yǎng)條件和添加定制培養(yǎng)基添加劑等策略，提升難表達蛋白的穩(wěn)定性和表達量：
? 添加專屬添加劑：在培養(yǎng)過程中添加漢騰獨有的DTEasy專屬添加劑，能夠增強細胞對篩選壓力的耐受性，從而將蛋白產量提升至原表達量的3倍之多；
? 采用環(huán)軌搖晃式反應器：通過采用溫和的環(huán)軌搖晃式反應器，減少剪切應力和細胞損傷，延長有效細胞培養(yǎng)時間，提升蛋白產量；
? CBoost® 加強型工藝：在培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的篩選中采用漢騰生物的CBoost®加強工藝平臺，可將難表達蛋白的產量提升2倍。
通過對上游生產工藝的精細調控，DTEasy平臺能夠顯著提高難表達蛋白的產量，為客戶后續(xù)進行進一步CMC開發(fā)提供了可靠的工藝基礎。
結論
漢騰DTEasy工具箱，釋放難表達蛋白潛力
“
綜上，漢騰DTEasy平臺通過分子設計、優(yōu)選宿主、細胞系載體優(yōu)化以及定制工藝，多管齊下，全面解決了難表達蛋白的開發(fā)痛點。借助DTEasy平臺，可幫助客戶釋放高價值但傳統(tǒng)上難以表達的治療性蛋白藥物的生產潛力，加快了開發(fā)進度，為患者獲得更加創(chuàng)新的生物治療藥物提供了更多機會。